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Charakterisierung des Lernproteoms von Drosophila unter Verwendung von zellselektiver nicht-kanonischer Aminosäuremarkierung 

Die Bildung des Langzeitgedächtnisses ist ein von der Proteinsynthese abhängiger Prozess. Die Identität und Funktionalität des Proteoms, das während der LTM-Bildung neu synthetisiert wird, ist noch nicht vollständig geklärt. Unser Forschungsziel ist daher die Charakterisierung des Lernproteoms.

Wir befassen uns mit der Beschreibung des Lernproteoms von Drosophila unter Verwendung modernster Techniken, die von Dieterich und Kollegen entwickelt wurden. BONCAT (bio-orthogonales nicht-kanonisches Aminosäure-Tagging, Dieterich et al., 2006; Dieterich et al., 2007) und FUNCAT (fluoreszierendes NCAT; Dieterich et al., 2010) verwenden künstliche azidhaltige Aminosäuren (AA), die sich in neu synthetisierte Proteine einbauen und dort die natürliche Aminosäure Methionin ersetzen. Aufgrund ihrer Azidgruppe können sie über eine kupferkatalysierte 3+2-Azid-Alkin-Cycloaddition („Click-Chemie”; Rostovtsev et al., 2002) mit einem Alkin-Affinitätsmarker (BONCAT) oder einem Fluoreszenzmarker (FUNCAT) markiert und anschließend mittels Massenspektrometrie (BONCAT) identifiziert oder visualisiert (BONCAT & FUNCAT) werden.

Um Proteine in bestimmten Geweben exklusiv markieren zu können, haben wir außerdem GINCAT (genetisch eingeführtes NCAT) in Drosophila entwickelt (Erdmann et al., 2015). GINCAT verwendet das künstliche Azid-haltige AA Azidonorleucin (ANL; Link et al., 2006; Tanrikulu et al., 2009). Der endogene Translationsapparat kann ANL nicht als Ersatz für Methionin in Proteine einbauen, da die Azid-haltige Seitenkette von ANL zu lang ist, um in die Aminosäure-Bindungsstelle des Wildtyp-MetRS zu passen. Durch Verwendung einer einzigen Aminosäuremutation (Leucin zu Glycin) in der Methionin-Bindungsstelle konnten wir MetRSLtoG-Konstrukte erfolgreich in das Drosophila-Genom einbauen, die die Einbindung von ANL unter der Kontrolle der Upstream-Aktivierungsstelle (UAS) ermöglichen. Die Erzeugung dieser transgenen Fliegen ermöglicht die gezielte Expression von MetRSLtoG und damit die Einbindung von ANL in Proteine ausgewählter Gal4-gesteuerter Zelltypen in lebenden Drosophila nach Ereignissen wie Lernen und anschließender Visualisierung mittels FUNCAT oder biochemischer Analyse und Massenspektrometrie mittels BONCAT.